Charakterisierung der DNA-Replikation in genetisch modifizierten Escherichia coli Stämmen durch neue Methoden der Synthetischen Biologie

Eukaryoten und Prokaryoten unterscheiden sich in der Organisation ihrer Genome. Prokaryoten tragen mehrheitlich ein zirkuläres Chromosom, welches von einem Replikationsursprung repliziert wird. Das eukaryotische Genom hingegen umfasst mehrere lineare Chromosomen, die mehr als einen Replikationsursprung enthalten. In wie weit die prokaryotische Genomorganisation der eukaryotischen angepasst werden kann, ist eine spannende Frage, von deren Antwort grundlegende Konstruktionsregeln für die Entwicklung von synthetischen Chromosomen abgeleitet werden könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden Escherichia coli Stämme mit multiplen Replikationsursprüngen und Chromosomen bezüglich ihrer DNA-Replikation untersucht und es wurde eine fluoreszenzbasierte Einzelzell-Methode designt und etabliert, die eine verbesserte „signal to background ratio“ aufweist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: I. E. coli toleriert einen zusätzlichen Replikationsursprung auf dem Chromosom, der aktiv repliziert. Dieser Ansatz funktioniert sowohl mit einer zusätzlichen Kopie von oriC, als auch mit oriII, dem Replikationsursprung des zweiten Chromosoms von V. cholerae. Es konnte gezeigt werden, dass eine verkürzte oriC-Sequenz, die keine DnaA-Box R4 enthält, nicht ausreichend für die DNA-Replikation auf dem nativen Chromosom ist. Wird oriII als extra Replikationsursprung eingesetzt, verläuft die DNA-Replikation dysreguliert. Diese Dysregulation wird aufgehoben, sobald sich oriC und oriII nicht mehr auf dem gleichen Chromosom, sondern auf zwei unterschiedlichen Replikons befinden. II. Für das Design und die Assemblierung von DNA-Sequenzbibliotheken zur chromosomalen Integration in Bakterien wurde das Programm MARSeG (Motif Avoiding Randomized Sequence Generator) geschrieben und das MoClo-System optimiert. Mit dem Sequenzgenerator MARSeG, ist es möglich Sequenzen zu designen, die eine hohe Variabilität aufweisen und gleichzeitig bestimmte DNA-Motive ausschließen. Das MoClo-System wurde optimiert um die Klonierungseffizienz zu erhöhen, Assemblierungen im Bibliotheken-Maßstab zu vereinfachen und eine Genomintegration assemblierter DNA-Fragmente einfacher zu gestalten. Mit Hilfe von MARSeG und den modifizierten MoClo-Vektoren konnte das Design und der Aufbau eines LacO/TetO hybrid FROS-Arrays effizient und schnell vollzogen werden. III. Es wurde eine neue Einzelzell-Methode etabliert mit der das Hintergrundsignal konventioneller FROS (Fluorescence Repressor Operator System) stark reduziert wird. Die neue Methode BiFCROS (Bimolecular Fluorescence complementation and Repressor Operator System) basiert auf Fusionen aus Repressoren und fragmentierten Fluoreszenzproteinen, die an ein hybrid FROS-Array binden, wodurch es durch Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation zu einem Fluoreszenzsignal kommt. BiFCROS enthält im Vergleich zum konventionellen FROS eine deutlich verminderte Hintergrundfluoreszenz, weil nur Proteine fluoreszieren, die an das Operator-Array gebunden sind. Um zu analysieren, ob BiFCROS für die Kopienzahlbestimmung von Genloki eingesetzt werden könnte, wurde es in diese Richtung weiterentwickelt. Anhand der Fluoreszenzintensität der gesamten Zelle könnte Rückschluss auf die Kopienzahl des hybrid FROS-Arrays gezogen werden, weil diese mit Anstieg der Kopienzahl proportional zunehmen sollte

Charakterisierung der DNA-Replikation in genetisch modifizierten Escherichia coli Stämmen durch neue Methoden der Synthetischen Biologie

Eukaryoten und Prokaryoten unterscheiden sich in der Organisation ihrer Genome. Prokaryoten tragen mehrheitlich ein zirkuläres Chromosom, welches von einem Replikationsursprung repliziert wird. Das eukaryotische Genom hingegen umfasst mehrere lineare Chromosomen, die mehr als einen Replikationsursprung enthalten. In wie weit die prokaryotische Genomorganisation der eukaryotischen angepasst werden kann, ist eine spannende Frage, von deren Antwort grundlegende Konstruktionsregeln für die Entwicklung von synthetischen Chromosomen abgeleitet werden könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden Escherichia coli Stämme mit multiplen Replikationsursprüngen und Chromosomen bezüglich ihrer DNA-Replikation untersucht und es wurde eine fluoreszenzbasierte Einzelzell-Methode designt und etabliert, die eine verbesserte „signal to background ratio“ aufweist. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: I. E. coli toleriert einen zusätzlichen Replikationsursprung auf dem Chromosom, der aktiv repliziert. Dieser Ansatz funktioniert sowohl mit einer zusätzlichen Kopie von oriC, als auch mit oriII, dem Replikationsursprung des zweiten Chromosoms von V. cholerae. Es konnte gezeigt werden, dass eine verkürzte oriC-Sequenz, die keine DnaA-Box R4 enthält, nicht ausreichend für die DNA-Replikation auf dem nativen Chromosom ist. Wird oriII als extra Replikationsursprung eingesetzt, verläuft die DNA-Replikation dysreguliert. Diese Dysregulation wird aufgehoben, sobald sich oriC und oriII nicht mehr auf dem gleichen Chromosom, sondern auf zwei unterschiedlichen Replikons befinden. II. Für das Design und die Assemblierung von DNA-Sequenzbibliotheken zur chromosomalen Integration in Bakterien wurde das Programm MARSeG (Motif Avoiding Randomized Sequence Generator) geschrieben und das MoClo-System optimiert. Mit dem Sequenzgenerator MARSeG, ist es möglich Sequenzen zu designen, die eine hohe Variabilität aufweisen und gleichzeitig bestimmte DNA-Motive ausschließen. Das MoClo-System wurde optimiert um die Klonierungseffizienz zu erhöhen, Assemblierungen im Bibliotheken-Maßstab zu vereinfachen und eine Genomintegration assemblierter DNA-Fragmente einfacher zu gestalten. Mit Hilfe von MARSeG und den modifizierten MoClo-Vektoren konnte das Design und der Aufbau eines LacO/TetO hybrid FROS-Arrays effizient und schnell vollzogen werden. III. Es wurde eine neue Einzelzell-Methode etabliert mit der das Hintergrundsignal konventioneller FROS (Fluorescence Repressor Operator System) stark reduziert wird. Die neue Methode BiFCROS (Bimolecular Fluorescence complementation and Repressor Operator System) basiert auf Fusionen aus Repressoren und fragmentierten Fluoreszenzproteinen, die an ein hybrid FROS-Array binden, wodurch es durch Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation zu einem Fluoreszenzsignal kommt. BiFCROS enthält im Vergleich zum konventionellen FROS eine deutlich verminderte Hintergrundfluoreszenz, weil nur Proteine fluoreszieren, die an das Operator-Array gebunden sind. Um zu analysieren, ob BiFCROS für die Kopienzahlbestimmung von Genloki eingesetzt werden könnte, wurde es in diese Richtung weiterentwickelt. Anhand der Fluoreszenzintensität der gesamten Zelle könnte Rückschluss auf die Kopienzahl des hybrid FROS-Arrays gezogen werden, weil diese mit Anstieg der Kopienzahl proportional zunehmen sollte

Design and Assembly of DNA Sequence Libraries for Chromosomal Insertion in Bacteria Based on a Set of Modified MoClo Vectors

Efficient assembly of large DNA constructs is a key technology in synthetic biology. One of the most popular assembly systems is the MoClo standard in which restriction and ligation of multiple fragments occurs in a one-pot reaction. The system is based on a smart vector design and type IIs restriction enzymes, which cut outside their recognition site. While the initial MoClo vectors had been developed for the assembly of multiple transcription units of plants, some derivatives of the vectors have been developed over the last years. Here we present a new set of MoClo vectors for the assembly of fragment libraries and insertion of constructs into bacterial chromosomes. The vectors are accompanied by a computer program that generates a degenerate synthetic DNA sequence that excludes “forbidden” DNA motifs. We demonstrate the usability of the new approach by construction of a stable fluorescence repressor operator system (FROS)

DNA Replication in Engineered <i>Escherichia coli</i> Genomes with Extra Replication Origins

The standard outline of bacterial genomes is a single circular chromosome with a single replication origin. From the bioengineering perspective, it appears attractive to extend this basic setup. Bacteria with split chromosomes or multiple replication origins have been successfully constructed in the last few years. The characteristics of these engineered strains will largely depend on the respective DNA replication patterns. However, the DNA replication has not been investigated systematically in engineered bacteria with multiple origins or split replicons. Here we fill this gap by studying a set of strains consisting of (i) <i>E. coli</i> strains with an extra copy of the native replication origin (<i>oriC</i>), (ii) <i>E. coli</i> strains with an extra copy of the replication origin from the secondary chromosome of <i>Vibrio cholerae</i> (<i>oriII</i>), and (iii) a strain in which the <i>E. coli</i> chromosome is split into two linear replicons. A combination of flow cytometry, microarray-based comparative genomic hybridization (CGH), and modeling revealed silencing of extra <i>oriC</i> copies and differential timing of ectopic <i>oriII</i> copies compared to the native <i>oriC</i>. The results were used to derive construction rules for future multiorigin and multireplicon projects

Establishing a System for Testing Replication Inhibition of the Vibrio cholerae Secondary Chromosome in Escherichia coli

Regulators of DNA replication in bacteria are an attractive target for new antibiotics, as not only is replication essential for cell viability, but its underlying mechanisms also differ from those operating in eukaryotes. The genetic information of most bacteria is encoded on a single chromosome, but about 10% of species carry a split genome spanning multiple chromosomes. The best studied bacterium in this context is the human pathogen Vibrio cholerae, with a primary chromosome (Chr1) of 3 M bps, and a secondary one (Chr2) of about 1 M bps. Replication of Chr2 is under control of a unique mechanism, presenting a potential target in the development of V. cholerae-specific antibiotics. A common challenge in such endeavors is whether the effects of candidate chemicals can be focused on specific mechanisms, such as DNA replication. To test the specificity of antimicrobial substances independent of other features of the V. cholerae cell for the replication mechanism of the V. cholerae secondary chromosome, we establish the replication machinery in the heterologous E. coli system. We characterize an E. coli strain in which chromosomal replication is driven by the replication origin of V. cholerae Chr2. Surprisingly, the E. coli ori2 strain was not inhibited by vibrepin, previously found to inhibit ori2-based replication